Многофункциональные дезинфицирующие растворы: новые методы тестирования, данные исследований, эффективность в отношении Acantamoeba

После вспышки акантамёбного кератита в 2007¹ году FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) вплотную занялось вопросами снижения заболеваемости, в том числе лицензированием средств ухода за линзами.

Ранее Acanthamoeba не входила в стандартный набор штаммов микроорганизмов, утвержденный международным стандартом ISO 14729 для тестирования средств ухода за контактными линзами, поскольку считалось, что демонстрация адекватной антибактериальной активности достаточна в том числе и для ограничения роста Acanthamoeba².

Однако вспышка заболеваемости и случаев контаминации линз и контейнера, несмотря на соблюдение рекомендаций по уходу, отсутствие стандартизированных рекомендаций по гигиене контейнеров для контактных линз, заставили вернуться к этому вопросу.

Хотя производители контактных линз регулярно тестировали свои продукты на различных штаммах Acanthamoeba, полученные результаты сильно различались в зависимости от использованных штаммов и метода культивирования трофозоитов и цист. Задача состоит в том, чтобы согласовать стандартизированный метод, который можно было бы повторить в разных лабораториях.

В 2021 году Алкон предложил новый метод тестирования средств ухода в отношении Acanthamoeba, который является достаточно простым, точным, позволяет визуализировать и сравнивать дезинфицирующую активность разных растворов³.

Многофункциональные растворы для контактных линз

Многофункциональные растворы для контактных линз, представленные на рынке, используют различные процентные содержания и комбинации дезинфектантов для уменьшения роста микробов во время нахождения контактных линз в контейнере.

Дезинфектанты первого поколения МФР — хлоргексидин, тимеросал — обеспечивали достаточно эффективную дезинфекцию, но более частые токсические и аллергические реакции⁴.

В современных МФР широко используются следующие дезинфектанты⁴:

• Бигуаниды являются дезинфектантами широкого спектра действия.

  • Полимерные бигуаниды (полиаминопропилбигуанид, полигексанид) являются производными хлоргексидина, но имеют более крупную молекулу, что позволяет снизить негативное воздействие на ткани глаза⁴.
  • Бигуаниды с небольшим размером молекулы (алексидин) используются как дополнительный дезинфектант в системах с двумя консервантами. Алексидин имеет механизм действия схожий с хлоргексидином, но в концентрациях, используемых в современных препаратах, не токсичен для поверхности глаза⁴.
• Четвертичные соединения аммония — поликвад (поликватерниум-1, полидрония хлорид) показывает преимущественно антибактериальную эффективность в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий⁵. Имеет самую крупную молекулу из консервантов, использующихся в МФР. Благодаря крупному размеру молекулы, поликвад не повреждает мембрану клеток млекопитающих и не обладает детергентными свойствами. Большой размер молекулы также сводит к минимуму абсорбцию консерванта материалом линзы, что снижает вероятность токсических реакций⁴. Помимо средств ухода за линзами, поликвад широко используется в качестве консерванта в офтальмологических каплях.
• Амидоамины, например миристамидопропилдиметиламин (алдокс), имеет высокую эффективность в отношении грибов и простейших благодаря своим катионным свойствам⁵. Исследования показывают эффективность в отношении цист акантамёбы⁶.

Биоциды, используемые в МФР, электростатически взаимодействуют с клеточными мембранами микроорганизмов, вызывая утечку внутриклеточных компонентов. Различные дезинфектанты могут иметь разную эффективность в отношении различных микроорганизмов, потому многие варианты современных МФР включают комбинацию двух или более биоцидов. Сочетание дезинфектантов позволяет расширить спектр действия раствора и потенциально снизить концентрацию каждого химического вещества в составе, что позволяет в целом снизить воздействие на глазную поверхность².

Эффективность дезинфекции

Эффективность дезинфекции МФР оценивается в стандартном тесте ISO, которое включает использование пяти стандартных тест-организмов: трех бактерий (S. marcescens, P. aeruginosa, S. aureus) и двух грибов (C. albicans, F. solani). При проведении автономного испытания в многофункциональный раствор вводят стандартный штамм из коллекции микроорганизмов и определяют степень потери их жизнеспособности за минимальное время дезинфекции, указанное производителем. Вводимая микробная проба содержит определенное количество колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов, на основании чего определяют скорость и степень потери их жизнеспособности².

Акантамеба не включена в стандарт ISO 14729, так как в настоящее время не существует согласованного стандартного метода тестирования активности растворов в отношении трофозоитов и цист Acanthamoeba. Хотя это и не требуется стандартом, большинство производителей тестируют эффективность средств ухода против Acanthamoeba. Однако в данный момент не существует стандартизированного метода тестирования и, следовательно, стандартных критериев для определения эффективности против Acanthamoeba. Учитывая, что ISO 14729 является единственным стандартным методом тестирования антимикробной эффективности, этот же метод обычно применяется для Acanthamoeba. Однако, поскольку этот метод не является специфическим для Acanthamoeba и не существует критериев эффективности, установленных для Acanthamoeba, этот тест обычно называют «модифицированным методом автономного тестирования ISO 14729».

Оценка эффективности дезинфекции: традиционный метод (модифицированный автономный тест ISO 14729 для количественной оценки эффективности МФР против трофозоитов Acanthamoeba³.

Штаммы трофозоитов Acanthamoeba ATCC 30461 и ATCC 50370 (генотипа Т4) тестировали с использованием начальной концентрации 5,0×10⁵ клеток/мл. Равное количество инокулята вводится в каждый из исследуемых МФР. Каждый инокулированный МФР выдерживали при комнатной температуре в течение рекомендованного производителем времени дезинфекции (таблица 1). Противомикробную эффективность определяли путем расчета логарифмического сокращения между исходными контрольными инокулятами и количеством клеток в МФР после времени дезинфекции.

Каждый штамм Acanthamoeba был протестирован в двух независимых испытаниях в разные дни, и результаты были усреднены. Все МФР были протестированы одновременно с использованием одного и того же посевного материала для прямого сравнения. Все статистические анализы проводились с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента при условии равной дисперсии.

Новый метод для количественной оценки и визуализации эффективности МФР против трофозоитов Acanthamoeba с использованием красителя йодида пропидия⁹.

Новая методика разработана Alcon в качестве еще одного метода для количественного определения эффективности средств ухода за контактными линзами против трофозоитов Acanthamoeba. Этот метод также позволяет легко визуализировать результат и сравнивать эффективность различных дезинфицирующих растворов.

Пропидий йодид (propidium iodide, PI) представляет собой флуоресцентный краситель, способный связываться с ДНК и окрашивать ядро клетки. PI позволяет идентифицировать мертвые клетки, окрашивая только ядра клеток, мембрана которых повреждена. Этот метод флуоресцентной клеточной маркировки помогает дифференцировать эффективность дезинфектанта на основе окрашивания погибших клеток. Результаты данного метода показали высокую корреляцию с результатами модифицированного теста ISO 14729.

Методология

В черный 96-луночный планшет с прозрачным дном высевали штаммы трофозоитов Acanthamoeba АТСС 30461 и АТСС 50370, используя исходную концентрацию 105 клеток/лунку. В каждую ячейку добавляли МФР и выдерживали в течение времени дезинфекции, рекомендованного производителем (таблица 1). Затем МФР удаляли, оставляя клетки в ячейке, и добавляли раствор PI. Интенсивность флуоресценции (544 нм/620 нм) измеряли сразу после добавления PI с использованием считывающего устройства для микропланшетов BioTek, а затем клетки отображали на конфокальном микроскопе. Все статистические анализы проводились с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента при условии равной дисперсии.

Результаты

Трофозоиты Acanthamoeba ATCC 30461 показали значительно более высокую интенсивность флуоресценции при окрашивании PI для ОПТИ-ФРИ^® PureMoist^® (85 854) в сравнении с Acuvue RevitaLens (36 362), Renu Advanced Formula (18 785) и Biotrue (17 873) (p <0,001). (Рисунок 6А). Трофозоиты Acanthamoeba ATCC 50370 также показали значительно более высокую интенсивность флуоресценции при окрашивании PI для ОПТИ-ФРИ^® PureMoist^® (48 547) по сравнению с Acuvue RevitaLens (34 884), Renu Advanced Formula (35 345) и Biotrue (11 101) (p <0,001).) (Рисунок 6B).

Кроме того, картина интенсивности флуоресценции (гибели клеток) среди протестированных МФР показала высокую корреляцию с результатами традиционного модифицированного метода тестирования ISO. Это дополнительно подтверждает разницу в эффективности многофункциональных растворов в отношении Acanthamoeba.

Заключение

• Акантамёба может вызвать серьезную инфекцию роговицы, известную как Акантамёбный кератит (АК) — тяжелое рецидивирущее заболевание роговицы, которое плохо поддается лечению и может приводить к необратимой потере зрения.
• В большинстве случаев АК возникает у пользователей контактных линз, ключевые фактора риска — несоблюдение рекомендаций по уходу и контакт линз с водой.
• Для специалиста по контактной коррекции очень важно выявлять поведенческие привычки, связанные с риском воздействия воды на контактные линзы, а также постоянно обучать пациента и контролировать соблюдение рекомендаций.
• Рекомендация средств для ухода за контактными линзами, обладающих высокой эффективностью против акантамёбы, может помочь в снижении вероятности развития этой разрушительной инфекции роговицы у ваших пациентов.

Мнение экспертов

Ирина
Потапова

Медицинский оптик-оптометрист, руководитель центра оптометрии Ирины Потаповой

Проактивный подход специалиста при назначении пациенту средств ухода за линзами — ключевой фактор безопасного ношения контактных линз. Все мы знаем, что несоблюдение рекомендаций при ношении контактных линз повышает риск инфекционных осложнений. Однако даже при соблюдении всех правил гигиены и рекомендаций специалиста, ношение контактных линз может оказывать влияние на баланс микробиоты глаза, потому я особое внимание уделяю выбору средств ухода. Мои секреты успешной практики:

• Для своих пациентов я выбираю растворы, которые сочетают несколько функций: надежную дезинфекцию, очищение и увлажнение. Например, Раствор ОПТИ-ФРИ Pure Moist содержит два противомикробных агента, рассчитанных на борьбу не только с различными видами грибов и бактерий, но даже с акантамёбой.
• Важно, чтобы раствор подходил даже для чувствительных глаз — потому особое внимание я обращаю на вид консерванта в растворе.
• От выбора средства ухода очень сильно зависит время комфортного ношения контактных линз. Эффективное увлажнение поможет уменьшить ощущение сухости в конце дня.
• Я очень детально и понятно проговариваю с пациентом основные этапы ухода, подчёркивая самые важные пункты: ежедневная замена раствора, обязательная механическая очистка, недопущение контакта линзы с водой.
• Обязательно назначаю несколько повторных визитов, особенно после перевода своих с пациентов с контактных линз однодневной замены на плановую. На повторных приемах, я прошу своих пациентов рассказать, как именно они хранят и дезинфицируют линзы. Считаю, что качественное обучение — залог здоровья моих пациентов.

RU-DEOH-2100004 ООО Алкон Фармацевтика 125315, г. Москва, пр. Ленинградский, д. 72, корп. 3 Тел.: +7 (495) 775-68-69; +7 (495) 961-13-33. Факс: +7 (495) 961-13-39

ИНФОРМАЦИЯ ПРЕДНАЗНАЧЕНА ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ РАБОТНИКОВ